Un motor de trinquete rotatorio de origami de ADN

Nov 05, 2023

Nature volumen 607, páginas 492–498 (2022)Citar este artículo

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Para impartir direccionalidad a los movimientos de un mecanismo molecular, se deben superar las fuerzas térmicas aleatorias que son omnipresentes en escalas tan pequeñas y en solución líquida a temperatura ambiente. En equilibrio sin suministro de energía, el movimiento direccional no puede sostenerse sin violar las leyes de la termodinámica. En condiciones alejadas del equilibrio termodinámico, el movimiento direccional puede lograrse dentro del marco de los trinquetes brownianos, que son mecanismos de difusión que han roto la simetría de inversión1,2,3,4,5. Se cree que el trinquete sustenta la función de muchos motores biológicos naturales, como la F1F0-ATPasa6,7,8, y se ha demostrado experimentalmente en sistemas sintéticos a microescala (por ejemplo, hasta donde sabemos, primero en la referencia 3) y también en motores moleculares artificiales creados por síntesis química orgánica9,10,11,12. La nanotecnología de ADN13 ha producido una variedad de mecanismos a nanoescala, incluidos pivotes, bisagras, manivelas deslizantes y sistemas giratorios14,15,16,17, que pueden adoptar diferentes configuraciones, por ejemplo, activadas por reacciones de desplazamiento de hebras18,19 o cambiando parámetros ambientales como como pH, fuerza iónica, temperatura, campos externos y acoplando sus movimientos a los de las proteínas motoras naturales20,21,22,23,24,25,26. Este trabajo previo y considerando la dinámica de bajo número de Reynolds y la estocasticidad inherente27,28 nos llevó a desarrollar un motor rotatorio a nanoescala construido a partir de origami de ADN que es impulsado por trinquete y cuyas capacidades mecánicas se acercan a las de los motores biológicos como F1F0-ATPasa.

Usamos los métodos de origami de ADN29,30 para diseñar y fabricar un pedestal de 40 nm de alto y 30 nm de ancho sobre el cual fijamos una plataforma triangular equilátera con bordes de 60 nm de largo y un grosor de 13 nm (Fig. 1a-c y Figuras complementarias 1 y 2). Una sección del pedestal que sobresale a través de la cavidad central de la plataforma triangular incluye un sitio de acoplamiento para un brazo de rotor. El sitio de acoplamiento se fija por medio de un punto de pivote que consta de tres nucleótidos desapareados cerca del punto medio de la plataforma triangular en el pedestal. El brazo del rotor, a su vez, consta de dos módulos de varilla rígida unidos de extremo a extremo (cada uno un origami de ADN separado) (Fig. 1d, e y Fig. 3 complementaria) con una longitud total de 550 nm. La longitud del brazo del rotor se eligió para permitir el seguimiento de los cambios de orientación angular de los motores individuales en tiempo real en un microscopio de fluorescencia de difracción limitada y para ralentizar los movimientos angulares a través de la fricción viscosa con el solvente, inspirado en los experimentos clásicos de Kinosita y otros que mostró la rotación de motores F1-ATPasa marcados con F-actina individuales8. Los módulos de varilla consistían en diez hélices dobles de ADN dispuestas en un patrón de celosía de panal (Fig. 1d, e). Anteriormente se ha demostrado que tales haces helicoidales tienen longitudes persistentes en el régimen de varios micrómetros31. Por lo tanto, el brazo del rotor puede considerarse como una varilla rígida pero elástica. El brazo del rotor sobresale a ambos lados del punto de pivote más allá de los límites de la plataforma triangular. Con este diseño, el brazo del rotor está restringido estéricamente a rotaciones uniaxiales alrededor del punto de pivote dentro del plano del triángulo. También instalamos obstáculos físicos en los tres bordes de la plataforma triangular (Fig. 1c). Los obstáculos consisten en placas rectangulares de 18 nm de largo que sobresalen con una inclinación de unos 50° desde la superficie de la plataforma triangular. Las placas se mantuvieron rígidamente en este ángulo con un conjunto de espaciadores de doble hélice. Para superar los obstáculos al barrer sobre la plataforma triangular, el brazo del rotor debe doblarse hacia arriba. La flexión constituye una barrera energética que puede atrapar el rotor entre obstáculos de forma ponderada por Boltzmann. El motor también incluye modificaciones funcionales como fracciones de biotina y tintes fluorescentes (Fig. 1f) para permitir la observación experimental del movimiento de partículas motoras individuales. Con las fracciones de biotina, los estatores se pueden unir rígidamente a los cubreobjetos de vidrio del microscopio a través de varios enlaces de biotina-neutravidina por estator, y los múltiples tintes fluorescentes en las puntas del brazo rotatorio permiten determinar su orientación utilizando el seguimiento del centroide32 en relación con la posición de los por separado. plataforma triangular etiquetada (Fig. 1f).

a, b, Esquemas de un pedestal y una plataforma triangular, respectivamente. Los cilindros indican dobles hélices de ADN. c, Ilustración esquemática de los pasos de montaje del motor. d,e, Componentes del brazo del rotor. f, Izquierda, ilustración esquemática de la configuración experimental para observar la dinámica del motor en un microscopio TIRF invertido. El pedestal se fija a través de varios enlaces de biotina-neutravidina a un cubreobjetos de microscopio. Estrella naranja, tintes Cy5. Estrellas azules, posiciones de etiquetado para hebras del generador de imágenes DNA-PAINT. A la derecha, dos electrodos de platino se sumergen en la cámara de líquido desde arriba y se conectan a un generador de funciones que genera una corriente alterna de onda cuadrada para crear una modulación energética de eje fijo que actúa en todos los motores.

En el equilibrio térmico, cualquier movimiento en cualquier dirección se verá contrarrestado por el movimiento opuesto, de modo que el sistema no estará sesgado en el límite de tiempo prolongado; de lo contrario, tendríamos un móvil perpetuo. Por lo tanto, nuestro motor está diseñado para funcionar como un trinquete en condiciones fuera del equilibrio térmico. Para provocar un efecto de trinquete asimétrico o sesgado, aplicamos un campo de corriente alterna (CA) eléctrica no giratoria usando electrodos sumergidos en la cámara de líquido (Fig. 1f y ver también Datos extendidos Fig. 1). El campo provoca una corriente iónica alterna que fluye a través de la cámara de muestra a lo largo de un eje fijo. La fuerza neta promediada en el tiempo creada por esta modulación externa es cero. No hay información suministrada por la modulación externa que pueda dictar una rotación del motor. En cambio, dependiendo de la naturaleza y ubicación de los mínimos energéticos en el motor en relación con el eje del campo eléctrico, la modulación puede producir una asimetría cinética por ciclo de campo que hace que el motor se mueva con una dirección de rotación preferida (Datos extendidos Fig. 2 ).

Codificamos nuestro diseño de motor en secuencias de ADN29 (Conjuntos de datos complementarios 1–5) y autoensamblamos los motores en mezclas de reacción de un solo recipiente utilizando los procedimientos descritos anteriormente33. Evaluamos la calidad del autoensamblaje mediante análisis de movilidad electroforética en gel (datos extendidos, Fig. 3) y validamos la forma 3D del complejo motor, incluido el pedestal, la plataforma triangular y el muelle del rotor, con un mapa de densidad de electrones 3D que determinamos usando microscopía crioelectrónica de una sola partícula (cryo-EM) (Fig. 2a, b y Datos extendidos Fig. 4). Dentro de la resolución, el mapa de densidad de electrones mostraba todas las características estructurales principales deseadas, incluidos los obstáculos y el muelle del rotor. También validamos el ensamblaje correcto del complejo de motor completo con el brazo del rotor de longitud completa mediante imágenes con microscopía electrónica de transmisión (TEM) de tinción negativa (Fig. 2c).

a, Diferentes vistas de un mapa de densidad de electrones en 3D del bloque motor determinado por medio de crio-EM de una sola partícula (ver también Datos extendidos Fig. 4 y en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) bajo el código EMD-14358). b, detalle del mapa crio-EM del bloque del motor representado en diferentes umbrales de densidad en los que se pueden distinguir los tres obstáculos y el muelle del rotor. Recuadro, esquema que muestra los seis sitios de residencia preferidos del brazo del rotor. c, Imágenes ejemplares de TEM con tinción negativa de una variante de motor con un brazo de rotor largo adjunto. Barra de escala, 50 nm. d, Imágenes ejemplares de fluorescencia de una sola partícula. Barra de escala, 500 nm. Las imágenes muestran la desviación estándar de la intensidad media por píxel calculada en todos los fotogramas de los videos TIRF grabados. e, imágenes de DNA-PAINT que muestran las posiciones de la punta del brazo del rotor en relación con la plataforma del triángulo. Barra de escala, 500 nm.

La microscopía de fluorescencia de reflexión interna total (TIRF) de partículas de motor inmovilizadas en la superficie en equilibrio mostró partículas giratorias en las que el brazo del rotor habitaba preferentemente en seis posiciones discretas (Fig. 2d y Datos extendidos, Figs. 5a y 6). Estas posiciones correspondían a orientaciones con el brazo del rotor atrapado a ambos lados de los obstáculos que sobresalían, que establecimos utilizando imágenes DNA-PAINT34 (Fig. 2e y Extended Data Fig. 5b). Las imágenes de DNA-PAINT también proporcionan una ilustración convincente de las dimensiones relativas de la plataforma triangular frente al brazo del rotor mucho más largo. Nuestro complejo motor realiza así un mecanismo giratorio difusivo que presenta varios mínimos energéticos (Datos extendidos Fig. 7).

Usamos el seguimiento del centroide32 para determinar con mayor precisión la orientación del brazo del rotor por cuadro de los videos TIRF de una sola partícula. En equilibrio, es decir, cuando el campo externo estaba apagado, las partículas del motor mostraban movimientos giratorios aleatorios imparciales con desplazamientos angulares acumulativos que desaparecían, como se esperaba de las fluctuaciones de equilibrio en un paisaje energético (Fig. 3a y Datos extendidos Fig. 8). Por el contrario, cuando encendimos el campo de CA, una fracción de las partículas del motor (32,3 %) cambió inmediatamente de una rotación aleatoria no dirigida a una rotación procesiva con un sesgo direccional (Figs. 3a y Videos complementarios 1 y 2). La velocidad angular máxima que registramos fue de aproximadamente 250 vueltas completas por minuto y un número aproximadamente igual de motores giraron progresivamente en sentido horario (CW) y antihorario (CCW) cuando se encendió el campo (Fig. 3b).

a, Ejemplos de trazas de una sola partícula que muestran el desplazamiento angular acumulativo de las puntas de los brazos del rotor, con el campo de CA apagado durante los primeros 10 s. Azul y naranja, motores ejemplares que giran en sentido horario y antihorario, respectivamente; verde, una partícula que continuaba moviéndose sin tendencia aparente incluso cuando el campo estaba encendido. El campo de CA era una onda cuadrada de 5 Hz con una amplitud de 20 V, a menos que se especifique lo contrario. Se puede encontrar un primer plano de los primeros 10 s con el campo de CA desactivado en Datos extendidos Fig. 8. b, Histogramas de la velocidad angular de partículas individuales con campo desactivado (izquierda, N = 557) versus campo activado (derecha, N = 1.078). c, Ejemplos de trazas de un solo motor que muestran la influencia de la orientación del eje del campo de CA en la velocidad del motor. El eje del campo AC se hizo girar paso a paso en incrementos de 5°. Las líneas discontinuas indican puntos de tiempo en los que se actualizó la dirección del campo. d, Diagrama de dispersión de velocidades angulares corregidas por fase para diferentes ejes de campo de CA (N = 75). Los diagramas de caja muestran los percentiles 25 y 75, y los bigotes indican los percentiles 10 y 90. Las líneas rojas dentro de las cajas marcan la mediana. e, Líneas continuas, trazas ejemplares de una sola partícula vistas durante un barrido de frecuencia de CA, que muestran un motor giratorio CCW y CW. Las líneas punteadas dan la velocidad angular efectiva como giros/ciclos de campo. f, Líneas continuas, trazas ejemplares de una sola partícula vistas durante un barrido de voltaje, que muestran un motor giratorio CCW y CW. Las líneas punteadas dan la eficiencia de polarización direccional como en e. g, Diagrama de dispersión de velocidades angulares absolutas por ciclo de campo de CA para diferentes frecuencias (izquierda, N = 156) y diferentes voltajes (derecha, N = 28). Diagramas de caja y bigotes como en d. Consulte también los videos complementarios 1 a 8.

Datos fuente

La dirección de rotación y la velocidad angular efectiva de cada partícula del motor podrían controlarse mediante la orientación del eje del campo de CA en relación con las partículas del motor (que están fijadas en el sustrato). Para demostrar esta propiedad, utilizamos una configuración de cuatro electrodos que nos permitió ajustar la dirección efectiva del eje del campo de CA mediante una superposición de campos eléctricos aplicados en las direcciones x e y del plano del cubreobjetos de vidrio. En un conjunto de experimentos, giramos el eje del campo de CA en incrementos de 5° cada 1,6 s mientras registramos y rastreamos los movimientos de un solo motor. Como resultado, obtuvimos trayectorias de partículas individuales que dan un desplazamiento angular acumulativo por partícula individual en función del tiempo (Fig. 3c y Videos complementarios 3 y 4). A partir de estos datos, calculamos la velocidad angular efectiva de cada motor y la graficamos como una función de la orientación que tenía el eje del campo en cada incremento de 1,6 s (Datos extendidos Fig. 9). Para la mayoría de los motores, observamos una dependencia sinusoidal de la velocidad del motor en la dirección del campo, incluido el estancamiento y la inversión de la dirección. Cada motor tiene una orientación de campo de CA específica para la cual el motor muestra la velocidad máxima y mínima. Atribuimos estos 'cambios de fase' entre las velocidades del motor al hecho de que los motores están fijos con orientaciones aleatorias en el cubreobjetos de microscopía. Alineamos la velocidad angular con los datos de orientación del campo y calculamos el promedio y la desviación estándar de la velocidad angular en un conjunto de 75 partículas de motor, lo que proporciona una impresión de la variabilidad de velocidad de motor a motor (Fig. 3d). También caracterizamos la dinámica de los motores individuales en función de la frecuencia y amplitud del campo de CA (Fig. 3e-g y Videos complementarios 5-8). La velocidad angular efectiva de los motores dependía de la frecuencia de CA, con una frecuencia de conducción óptima de 5 Hz. El sesgo direccional de rotación estuvo ausente cuando se aplicaron campos de CC y también desapareció a altas frecuencias de CA (100 Hz). De manera similar, la velocidad angular de los motores también podría ser controlada por la amplitud del campo AC, mostrando una velocidad angular efectiva óptima en la banda de amplitud entre 20 y 60 V.

Sobre la base de los datos registrados, podemos estimar el par y el trabajo realizado sobre el medio ambiente por los motores, que, en nuestros experimentos para la Fig. 3, se disipó en forma de arrastre por fricción del brazo largo del rotor con el solvente. . El coeficiente de fricción rotacional para el brazo del rotor \(({\zeta }_{{\rm{r}}}=\pi \eta {L}^{3})\) es aproximadamente 4 × 10−22 N m s . Sobre la base de la velocidad angular máxima observada de 25 radianes s−1 (1500° s−1), llegamos a un par máximo de aproximadamente 10 pN nm, que puede compararse con los 50 pN nm que puede generar la F1F0-ATPasa35 . La potencia máxima estimada de nuestros motores disipada en fricción fue de 250 pN nm s−1 (62 kBT s−1), que corresponde al equivalente de la energía libre entregada por la hidrólisis de aproximadamente 2,5 moléculas de ATP por segundo en condiciones celulares.

Podemos obtener información sobre el mecanismo de nuestros motores al considerar los paisajes de energía efectiva en la Fig. 4a-c, calculados de manera ejemplar para diferentes orientaciones del campo del estator de un motor rotativo simplificado de dos mínimos (ver también Datos extendidos Fig. 2). La asimetría necesaria para la selección de la direccionalidad neta (sesgo o trinquete) es creada por la interacción entre el paisaje potencial estático de fondo proporcionado por el cuerpo del motor y el campo modulador externo. El alcance de la asimetría depende de la orientación del paisaje de energía del motor en relación con el campo (Fig. 4c), como lo ilustran de manera ejemplar las simulaciones dinámicas de Langevin en estos paisajes de energía que conducen a trayectorias de rotación con CW, CCW y ausencia de sesgo direccional, respectivamente. . Debido a que depositamos aleatoriamente partículas de motor en portaobjetos de microscopía en nuestros experimentos, obtuvimos una muestra aproximadamente uniforme de las orientaciones del motor en relación con el eje del campo y, por lo tanto, una muestra de motores que giran en sentido horario o antihorario a varias velocidades (Fig. 3c, d). Los videos complementarios 9–11 resumen esquemáticamente cómo la velocidad esperada del motor depende de la orientación, la frecuencia y la amplitud del campo.

a, Línea continua, paisaje esquemático de energía interna para un motor simplificado de dos mínimos. Líneas punteadas y discontinuas, contribución energética del campo de CA externo aplicado a lo largo del eje 0°–180°. Recuadros, funciones de energía en coordenadas polares. b, Líneas sólidas, instantáneas de la suma de la energía interna del motor más la contribución del campo. Líneas discontinuas, trayectoria esperada del brazo del rotor en la inversión de la dirección del campo. La posición inicial por medio ciclo de campo se indica con un punto. c, Paisajes de energía para el motor hipotético de dos mínimos de a y b trazados como superficies de espacio-tiempo 2D y calculados para tres orientaciones ejemplares del motor en relación con el eje del campo (ver recuadros). El eje del campo está a lo largo de la dirección 0°–180°. Puntos amarillos, trayectorias ejemplares de una sola partícula simuladas por la dinámica de Langevin. d, Distribución de desplazamientos angulares acumulativos después de dos, cuatro y seis ciclos de campo de CA agregados a partir de una trayectoria dinámica de Langevin simulada. Los picos prominentes a intervalos de 180° se deben a la doble simetría en el paisaje energético simulado. e, Análisis de irreversibilidad para motores simulados. Se muestra un conjunto promedio de más de 20 motores simulados evaluados en diferentes valores de desplazamiento y para intervalos de tiempo de dos, cuatro y seis ciclos de CA, como se indica por color. Los motores contienen una doble simetría como se ilustra en el panel a, en el que en el esquema azul se usaron orientaciones de motor con 45° con respecto al campo y en el esquema rojo se usaron orientaciones simétricas (0°). Líneas sólidas, guías a la vista para enfatizar la tendencia o la falta de ella. f, Análisis de irreversibilidad de partículas motoras observadas experimentalmente. La coloración de la distribución indica el intervalo de tiempo como en el panel d. Para tener en cuenta las variaciones en la velocidad de rotación, la tendencia lineal en cada rotor se volvió a normalizar a una pendiente de la unidad antes de calcular las distribuciones que se muestran. Se agregó una línea con pendiente unitaria para guiar el ojo. Ver datos extendidos Fig. 10b para el análisis de irreversibilidad de partículas observadas experimentalmente. g, izquierda, esquemas de una variante de motor que incluye un resorte torsional ssDNA en el punto de pivote. A la derecha, ejemplar desplazamiento angular acumulativo observado experimentalmente de partículas de motor individuales. Primera fase: campo AC apagado, resorte relajado. Segunda fase: campo de CA encendido, el resorte está enrollado. Tercera fase: campo de CA apagado, el resorte se está desenrollando e impulsando el movimiento. Ver también los videos complementarios 12 y 13.

Datos fuente

Para probar la irreversibilidad de nuestro mecanismo a nivel de motores individuales, analizamos las propiedades de sus fluctuaciones en el contexto de la termodinámica estocástica36. Si compilamos la distribución de los ángulos de desplazamiento en función del tiempo (en múltiplos del período T del campo de CA), esperamos que los rotores naturalmente tomen pasos estocásticos a lo largo de la dirección de la polarización y también en su contra (Fig. 4d y ver también Fig. 3a). La termodinámica estocástica nos permite investigar el grado de producción de entropía en un sistema en no equilibrio con una trayectoria finita, a partir de la relación entre las tasas de transición aguas arriba y aguas abajo. Denotando \({\rm{P}}\left({\theta }_{0}+\Delta \theta ,t| {\theta }_{0,}0\right)\) como la probabilidad de rotación por ángulo Δθ durante el período t desde la posición inicial de θ0, esperamos una relación de fluctuación que explore la irreversibilidad al extraer la producción de entropía promedio Δs en los nanomotores durante el período de tiempo t = nT (un múltiplo entero del período del campo de CA ), en la forma

donde ωeff y Deff representan la velocidad angular efectiva y el coeficiente de difusión, respectivamente, de los nanomotores a lo largo de la dinámica de trinquete estocástica. El coeficiente de difusión efectivo está relacionado con un coeficiente de fricción efectivo ζeff, que depende del mecanismo microscópico del impulso de no equilibrio. Tenga en cuenta que la ecuación (1) es independiente del tiempo t = nT. Esta relación se mantiene en las simulaciones que realizamos (Fig. 4e) y también se mantiene en los datos experimentales de motores giratorios procesivos (Fig. 4f), como se ve por el colapso de todas las parcelas a una línea de pendiente unidad en el no -Casos de equilibrio mediante un reescalado de las pendientes. El impulso de no equilibrio también se puede investigar en el desplazamiento cuadrático medio que muestra un cruce del comportamiento difusivo al balístico (Datos extendidos Fig. 10a). Podemos presentar una estimación teórica aproximada de la eficiencia del motor. Cuando el sistema opera contra un torque externo τ, su velocidad angular neta será \({\omega }_{{\rm{eff}}}\left(\tau \right)={\omega }_{{\rm {eff}}}-\tau /{\zeta }_{{\rm{r}}}\), de donde el trabajo útil por unidad de tiempo de \({\omega }_{{\rm{eff}} }\left(\tau \right)\times \tau =({\omega }_{{\rm{eff}}}-\tau /{\zeta }_{r})\times \tau \) puede ser extraído, con una eficiencia nominal estimada de \(\epsilon \equiv \frac{({\omega }_{{\rm{eff}}}-\tau /{\zeta }_{{\rm{r}}} )\times \tau \,}{{{\rm{\zeta }}}_{{\rm{eff}}}{\times {\rm{\omega }}}_{{\rm{eff}} }^{2}}\) . Por lo tanto, el trabajo máximo se puede extraer cuando \(\tau ={\zeta }_{{\rm{r}}}{\omega }_{{\rm{eff}}}/2\), lo que lleva a un limitada a la eficiencia nominal de \(\epsilon \le \frac{{\zeta }_{{\rm{r}}}\,}{{4{\rm{\zeta }}}_{{\rm{ ef}}}}\).

También probamos si nuestros motores podían generar torque contra una carga adicional. Con este fin, diseñamos variantes de motor que incluían un resorte de torsión en el punto de pivote (Fig. 4g, Fig. 11 de datos ampliados y Fig. 4 complementaria). El resorte de torsión constaba de un bucle de ADN monocatenario con un extremo fijado en el pedestal y el otro en el brazo del rotor. Las rotaciones del rotor enrollarán el bucle como un resorte entrópico alrededor de la conexión del pivote del rotor. El devanado produce una fuerza de restauración que eventualmente hace que el motor se detenga una vez que el par creado por el resorte enrollado equilibra el par máximo entregado por el motor. El resorte así tensado sirve entonces como un depósito de energía que puede impulsar el rotor en la dirección opuesta cuando se corta el suministro de energía externo, hasta que el resorte se relaja nuevamente. Este comportamiento predicho corresponde a lo que observamos: las partículas individuales que presentaban el resorte de torsión mostraron una rotación procesiva cuando el campo de CA estaba encendido hasta que se detuvo, y luego inmediatamente comenzaron a rotar procesivamente en la dirección opuesta una vez que se apagó el campo de CA (Fig. 4g y Vídeos complementarios 12 y 13).

En conclusión, nuestros motores rotativos macromoleculares pueden realizar trabajo, como lo demuestra su rotación sostenida contra el arrastre viscoso en la solución y su capacidad para enrollar un resorte de torsión molecular. Con velocidades angulares de hasta 250 revoluciones por minuto y pares de hasta 10 pN nm, los motores alcanzan velocidades de rotación y pares que se aproximan a los conocidos por potentes máquinas moleculares naturales, como la ATP sintasa. Los motores se mueven direccionalmente debido a propiedades mecánicas intrínsecas, alimentados por una simple modulación de energía externa que no necesita ninguna retroalimentación o información proporcionada por el usuario para dirigir los motores. Nuestros motores también ofrecen opciones de control con las que uno está familiarizado con los motores de macroescala: el usuario puede encenderlos y apagarlos a voluntad, responden rápidamente y se puede regular la velocidad y la dirección de rotación. Los motores pueden ser producidos y operados por cualquier persona que tenga acceso a equipos estándar de laboratorio húmedo. Basta con transmitir la información de la secuencia para que otros usuarios puedan replicar y construir sus propios motores utilizando moléculas de ADN obtenidas, por ejemplo, de fuentes comerciales. La producción de las moléculas de ADN requeridas se puede escalar a cantidades masivas37. Debido a la modularidad de los componentes del origami de ADN, esperamos que los motores también puedan modificarse, adaptarse e integrarse en otros contextos. Gopinath et al. han descrito recientemente cómo colocar y orientar objetos de origami de ADN en superficies de estado sólido estampadas de manera programable38,39. Estos métodos podrían usarse para construir matrices de motores con orientación controlada del estator en relación con el eje del campo, para lograr una rotación sincronizada40. Nuestro concepto de diseño y operación del motor también podría ser aplicable a otros sistemas más allá del origami de ADN. Por ejemplo, los conjuntos rotativos basados ​​en proteínas que presentan residuos cargados podrían presumiblemente diseñarse de novo y podrían ser impulsados ​​para girar con polarización direccional mediante campos de CA. Además, en lugar de campos eléctricos, presumiblemente también podrían usarse otros suministros de energía que alternan en direccionalidad, como flujos de fluidos alternos. Una próxima frontera natural sería explorar la causa de una modulación de barrera a través de una reacción química y explotar el movimiento del motor dirigido para impulsar la síntesis química cuesta arriba utilizando un mecanismo sintético más elaborado que presenta un movimiento recíproco coordinado, al igual que la F1F0-ATP sintasa sintetiza mecánicamente ATP impulsado por movimiento rotatorio.

Todas las estructuras se diseñaron utilizando cadnano 0.2 (ref. 41). El pedestal se plegó desde un andamio personalizado linealizado de 7585 bases de largo, mientras que el pedestal con resorte torsional se plegó desde un andamio de 8064 bases de largo, así como ambas partes del brazo del rotor. La plataforma triangular se plegó a partir de un andamio de 9.072 bases de largo42.

El andamio circular con una longitud de 8.064 bases se preparó como se describió anteriormente43 a partir de un biorreactor agitado de 2 l. El andamio circular de 9072 bases de longitud, así como el precursor circular del andamio lineal de 7585 bases de longitud, se prepararon a partir de cultivos en matraz agitado como se ha descrito anteriormente42. Para linealizar el andamio, se digirió con zinc como se describió anteriormente37.

Todas las mezclas de reacción de plegamiento contenían una concentración de andamio final de 50 nM y cadenas de oligonucleótidos (Integrated DNA Technologies (IDT)) de 500 nM cada una (para la plataforma triangular) o 200 nM cada una (para las otras estructuras). Los tampones de reacción de plegamiento contenían hidrocloruro de tris(hidroximetil)aminometano (TRIS-HCl) 5 mM, ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 1 mM, NaCl 5 mM y 10 mM (brazos de rotor), 15 mM (ambas variantes de pedestal) o 20 mM (formas triangulares). plataforma) MgCl2. Las soluciones de plegado se recocieron térmicamente utilizando dispositivos de ciclos térmicos Tetrad (MJ Research, ahora Bio-Rad). Las reacciones se dejaron a 65 °C durante 15 min y posteriormente se sometieron a una rampa de recocido térmico de 60 °C a 44 °C (1 °C h−1). Las estructuras plegadas se almacenaron a temperatura ambiente hasta los siguientes pasos de preparación de la muestra. Todas las secuencias de ADN están disponibles en las Tablas de datos complementarios 1–5.

Todas las estructuras plegadas se purificaron del exceso de oligonucleótidos mediante precipitación con polietilenglicol (PEG) (variantes de brazos de rotor y pedestal) o mediante extracción física de geles de agarosa (plataforma triangular). Los monómeros purificados en gel se concentraron mediante ultracentrifugación. La extensión del brazo del rotor purificada con PEG se incubó adicionalmente con un conjunto de cadenas de oligonucleótidos de conexión a una concentración de MgCl2 de 10 mM durante 1 hora a 30 °C y, posteriormente, el PEG precipitó nuevamente. Todos los procedimientos se realizaron como se describió previamente33.

Como primer paso, los dos dímeros, la plataforma triangular y el pedestal (dímero 1), así como las dos partes del brazo del rotor (dímero 2), se ensamblaron mezclando una solución 1:1 de los respectivos monómeros a una concentración final de MgCl2 de 40 mM (dímero 1) y 5 mM (dímero 2), y se dejó a 40 °C durante al menos 16 h. A continuación, el dímero 1 se precipitó con PEG para cambiar el tampón a una concentración final de MgCl2 de 5 mM. Ambos dímeros se mezclaron y se incubaron en MgCl2 10 mM durante un mínimo de 16 h.

Las nanoestructuras de ADN plegadas y ensambladas se sometieron a electroforesis en geles de agarosa al 1,5% o al 2% que contenían tris-borato-EDTA 0,5x y MgCl2 5,5 mM durante 1,5 a 3 h a un voltaje de polarización de 90 o 100 V en una caja de gel enfriada con agua. Los geles de agarosa sometidos a electroforesis se tiñeron con bromuro de etidio y se escanearon con un escáner láser Typhoon FLA 9500 (GE Healthcare) a una resolución de 50 μm por píxel.

Se adsorbió una cantidad de muestra de 5 μl en rejillas de Cu descargadas luminiscentes con soporte de carbón (producción interna y Science Services, Munich) y se tiñeron con una solución acuosa de formiato de uranilo al 2% que contenía NaOH 25 mM. Las muestras se incubaron durante diferentes períodos de tiempo dependiendo de la concentración. En general, las estructuras con concentraciones del orden de decenas de nM se incubaron durante 30 s, mientras que las muestras de menor concentración (5 nM o menos) se incubaron durante 5 a 10 min. Las imágenes se adquirieron utilizando un microscopio Philips CM100 que funciona a 100 kV.

La muestra purificada y concentrada se aplicó a rejillas (Protochips) C-Flat 2/1-4C (EMS) con descarga luminiscente y se congeló por inmersión utilizando un Vitrobot Mark V (FEI, ahora Thermo Scientific) con los siguientes ajustes: temperatura de 22 ° C, humedad del 90 %, 0 s de tiempo de espera, 3 s de tiempo de transferencia, -1 fuerza de transferencia, 0 s de tiempo de drenaje.

Los datos fueron adquiridos en un microscopio electrónico Titan Krios G2 operado a 300 kV equipado con un detector directo Falcon 3 usando el software EPU (Thermo Scientific). Se utilizó una exposición total de 3,3 s con una dosis de 44 e Angstrom−2 dividida en 11 fracciones.

El procesamiento de la imagen se realizó en RELION 3.0 (refs. 44,45). Se corrigió el movimiento de las micrografías y se estimó la función de transferencia de contraste usando MotionCor2 (ref. 46) y CTFFIND4.1 (ref. 47), respectivamente. Las partículas se recogieron usando crYOLO48. Las partículas seleccionadas automáticamente se extrajeron de las micrografías y se agruparon en 2, se sometieron a una ronda de clasificación 2D y 3D para eliminar las contaminaciones de la cuadrícula seleccionadas falsamente y las partículas dañadas, y para abordar la heterogeneidad estructural. Se reconstruyó un mapa 3D refinado utilizando un modelo inicial de baja resolución creado en RELION. Se utilizó un número total de 38.649 partículas para la reconstrucción final. El mapa se postprocesó usando una máscara filtrada de paso bajo para calcular las correlaciones de la capa de Fourier y estimar la resolución global de 16 Angstroms con un factor B establecido manualmente de −500.

Los monómeros se plegaron, purificaron y ensamblaron como se describió anteriormente. Los oligos biotinilados se incubaron con un exceso de 32x de neutravidina (Thermo Fisher Scientific) y luego se agregaron a los polímeros en un exceso de aproximadamente 10x al sitio de unión durante 1 a 2 horas a temperatura ambiente. La mezcla de reacción resultante se purificó en gel extrayendo solo las especies tetraméricas. Las concentraciones de la muestra fueron de aproximadamente 100 pM. Si era necesario, se añadía a la muestra un conjunto de dos cadenas de oligonucleótidos espaciadores en un exceso de aproximadamente 100x para montar los obstáculos en la plataforma triangular. Todas las muestras se almacenaron a temperatura ambiente hasta que se tomaron imágenes en el microscopio durante varias semanas.

La preparación de portaobjetos de vidrio de cubierta de biotina-PEG, la producción de la cámara de flujo y la configuración de microscopía TIRF son como se describió anteriormente en la ref. 25. Las muestras se diluyeron por debajo de 100 pM en un tampón de imágenes (FMB 500) que contenía NaCl 500 mM, TRIS-HCl 100 mM y EDTA 2 mM, se agregaron a la cámara de muestras y se inmovilizaron en la superficie de vidrio con biotina-estreptavidina-biotina. enlace. Las estructuras no unidas se eliminaron lavando con FMB 500 después de aproximadamente 5 min. Luego, la cámara de muestra se enjuagó dos veces con el tampón de imagen final (FMB 1.5) que contenía TRIS-HCl 150 mM, EDTA 1 mM, NaCl 1,5 M e incluía un sistema de eliminación de oxígeno con Trolox 2 mM (6-hidroxi-2,5,7 ácido ,8-tetrametilcromano-2-carboxílico), D-glucosa al 0,8%, 2.000 U ml−1 de catalasa y 165 U ml−1 de glucosa oxidasa. Para las medidas del resorte de torsión, se añadió sacarosa al 30 % y la concentración final de NaCl se redujo a 1 M. Las enzimas, Trolox y glucosa se adquirieron de Sigma-Aldrich. Finalmente, la cámara de muestras se llenó por completo con FMB 1.5 y se colocó en la parte superior de la cámara de flujo un tapón hecho a medida que asegura cables de platino de 0,2 mm de espesor, a los que se aplica el voltaje de operación. El voltaje aplicado fue controlado por una rutina de LabVIEW hecha a la medida que suministró voltajes de control a un amplificador operacional hecho a la medida para generar el voltaje de salida final. Los videos se adquirieron durante 40 a 64 s a una velocidad de cuadro de 250 cuadros s−1 con un campo CA uniaxial aplicado de 0 a 60 V y frecuencias de 1 a 100 Hz.

Las partículas en movimiento se localizaron manualmente, se ajustaron con Gauss y se seleccionaron con el software Picasso49. Todos los pasos sucesivos se realizaron utilizando un script de MATLAB personalizado. A partir del seguimiento de la posición de las puntas de los brazos del rotor, se obtuvo el desplazamiento angular acumulado. Además, las velocidades angulares (Ω) se calcularon de acuerdo con:

donde ϑ es el ángulo en el cuadro respectivo (primer y último cuadro de un período con o sin campo de CA externo) y ∆t indica la diferencia de tiempo entre esos dos cuadros. Se calculó un histograma de las velocidades angulares.

Para las imágenes de superresolución de DNA-PAINT, las tres esquinas de la plataforma triangular se etiquetaron con tres sitios de unión transitorios de DNA-PAINT. Después de adquirir los datos de difusión del rotor, el tampón de imágenes FMB 1.5, incluido el sistema de captación de oxígeno, se intercambió con una solución de imágenes DNA-PAINT que consta de 1 × TAE, MgCl2 12 mM, TWEEN20 al 0,05 % y hebras de imágenes P1 20 nM. Antes de la adquisición de los datos de DNA-PAINT, los fluoróforos del rotor se blanquearon mediante una mayor exposición a la excitación de 642 nm. Se grabaron videos de 7000 fotogramas con una exposición de 400 ms y una salida de láser de excitación de 642 nm de 70 mW. La detección puntual de los eventos de vinculación del generador de imágenes y el ajuste de Gauss de las funciones de dispersión de puntos se realizó con la función 'Localizar' del paquete de software Picasso. Posteriormente, se utilizó la función 'Renderizar' para visualizar la lista de eventos resultante y correlacionar los datos de superresolución de DNA-PAINT con los datos de las mediciones de difusión del rotor.

Para la simulación, vemos el brazo del rotor como una partícula browniana en un paisaje energético 1D dependiente del tiempo U(ϑ, t). Esto nos permite escribir la ecuación de primer orden

con constante de amortiguamiento λ y término de ruido η que satisface \(\left\langle \eta \left(t\right)\eta \left({t}^{{\prime} }\right)\right\rangle =\) \(2{k}_{{\rm{B}}}T\lambda \delta \left(t-{t}^{{\prime} }\right)\). El paisaje energético consiste en una contribución intrínseca del rotor independiente del tiempo y un campo eléctrico externo alterno

en el cual

representa el campo eléctrico externo alterno con período de oscilación T. Los parámetros a, b y c indican las intensidades relativas del campo eléctrico, el paisaje intrínseco del rotor y el ancho de los mínimos de energía locales, respectivamente. Además, ϑ0 describe el ángulo encerrado entre el rotor y el eje del campo y los mínimos de energía están separados por Δϑ. Para asegurar el vínculo con la dinámica rotacional, Δϑ debe ser una fracción simple de 2π. Para mejorar la estabilidad numérica, trabajamos con un paisaje de energía diferenciable y, por lo tanto, nos aproximamos a algún N grande:

El análisis de irreversibilidad descrito en el texto principal e ilustrado en la Fig. 4 se realiza con los datos de la siguiente manera. Dado un intervalo de tiempo Δt, uno calcula todos los pares \(\triangle {{\vartheta }}_{t}={{\vartheta }}_{n+t}-{{\vartheta }}_{n}\) de una serie de tiempo {ϑn}, en la que este ϑn mide la posición angular del rotor, incluidas las rotaciones completas anteriores.

A partir de estos datos, utilizamos una estimación de densidad kernel con kernels gaussianos (https://github.com/JuliaStats/KernelDensity.jl) de la distribución de probabilidad \(p\left({{\vartheta }}_{0}\, {\rm{mod}}\,360,\triangle {\vartheta }\right)\), que representa un salto desde la posición ϑ0 a ϑ0 + Δϑ. Usando esta distribución, calculamos

promediando las posiciones iniciales \({{\vartheta }}_{0}\in [0,360)\). El análisis de cada rotor k produce una función \({\left(\frac{\triangle s}{{k}_{{\rm{B}}}}\right)}_{k}\) que sigue aproximadamente tendencia lineal independiente de t. Las distribuciones estimadas sobre estas funciones se muestran en la Fig. 4 para rotores simulados y experimentales. La pendiente promedio de la tendencia resultante es proporcional al sesgo de rotación. Para tener en cuenta la notable variación en el sesgo rotacional en diferentes motores experimentales, todas las tendencias se volvieron a normalizar a una pendiente unitaria. Este paso de renormalización se vuelve mal definido para motores experimentales imparciales que, por lo tanto, fueron excluidos.

El mapa crio-EM que se muestra en la Fig. 2 está disponible en el Banco de datos de microscopía electrónica (EMDB) con el código de acceso EMD-14358. Cryo-EM y datos sin procesar de video de fluorescencia en tiempo real están disponibles del autor correspondiente a pedido. Las secuencias de oligos y andamios, así como los datos de origen, están disponibles en el archivo de información complementaria. Los datos de origen se proporcionan con este documento.

Los scripts de MATLAB para el análisis de datos de microscopía TIRF se pueden descargar desde https://github.com/DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies50.

Astumian, RD Termodinámica y cinética de un motor browniano. Ciencia 276, 917–922 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Reimann, P. Motores brownianos: transporte ruidoso lejos del equilibrio. física Rep. 361, 57–265 (2001).

Artículo ADS MathSciNet MATH Google Scholar

Rousselet, J., Salome, L., Ajdari, A. & Prost, J. Movimiento direccional de partículas brownianas inducidas por un potencial asimétrico periódico. Naturaleza 370, 446–448 (1994).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Astumian, RD & Hänggi, P. Motores brownianos. física Hoy 55, 33–39 (2002).

Artículo Google Académico

Hänggi, P. & Marchesoni, F. Motores brownianos artificiales: control del transporte en la nanoescala. Rev.Mod. física 81, 387 (2009).

Artículo ANUNCIOS Google Académico

Boyer, PD La ATP sintasa: una espléndida máquina molecular. año Rev. Bioquímica. 66, 717–749 (1997).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Pinke, G., Zhou, L. & Sazanov, LA Estructura Cryo-EM de toda la ATP sintasa de tipo F de mamífero. Nat. Estructura. mol. Biol. 27, 1077–1085 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Noji, H., Yasuda, R., Yoshida, M. & Kinosita, K. Jr. Observación directa de la rotación de F1-ATPasa. Naturaleza 386, 299–302 (1997).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Koumura, N., Zijlstra, RW, van Delden, RA, Harada, N. y Feringa, BL Rotor molecular monodireccional impulsado por luz. Naturaleza 401, 152–155 (1999).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kistemaker, JCM et al. Motores moleculares simétricos impulsados ​​por luz de tercera generación. Mermelada. química Soc. 139, 9650–9661 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wilson, MR et al. Un motor autónomo de molécula pequeña alimentado químicamente. Naturaleza 534, 235–240 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Hernández, JV, Kay, ER & Leigh, DA Un motor molecular rotatorio sintético reversible. Ciencia 306, 1532–1537 (2004).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Seeman, NC Nanomateriales basados ​​en ADN. año Rev. Bioquímica. 79, 65–87 (2010).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ramezani, H. & Dietz, H. Construcción de máquinas con moléculas de ADN. Nat. Rev. Genet. 21, 5–26 (2020).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Marras, AE, Zhou, L., Su, HJ & Castro, CE Movimiento programable de mecanismos de origami de ADN. proc. Academia Nacional. ciencia EE. UU. 112, 713–718 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ketterer, P., Willner, EM y Dietz, H. Aparato rotatorio a nanoescala formado a partir de componentes de ADN 3D ajustados. ciencia Adv. 2, e1501209 (2016).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

List, J., Falgenhauer, E., Kopperger, E., Pardatscher, G. & Simmel, FC Movimiento de largo alcance de grandes nanoestructuras de ADN entrelazadas mecánicamente. Nat. común 7, 12414 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, DY & Winfree, E. Control de la cinética de desplazamiento de la cadena de ADN mediante el intercambio de puntos de apoyo. Mermelada. química Soc. 131, 17303–17314 (2009).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Yurke, B., Turberfield, AJ, Mills, AP Jr., Simmel, FC y Neumann, JL Una máquina molecular alimentada por ADN hecha de ADN. Naturaleza 406, 605–608 (2000).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Gerling, T., Wagenbauer, KF, Neuner, AM y Dietz, H. Dispositivos y ensamblajes de ADN dinámico formados por componentes 3D de emparejamiento sin base, complementarios de forma. Ciencia 347, 1446–1452 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Ijas, H., Hakaste, I., Shen, B., Kostiainen, MA y Linko, V. Nanocápsula de origami de ADN reconfigurable para encapsulación y visualización de carga con control de pH. ACS Nano 13, 5959–5967 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Idili, A. & Ricci, F. en DNA Nanotechnology Vol. 1811 (ed. Zuccheri, G.) 79–100 (Humana Press, 2018).

Majikes, JM, Ferraz, LCC y LaBean, TH Actuación de origami de ADN impulsada por el pH a través de secuencias paralelas con motivo I en solución y en superficies. bioconjugador química 28, 1821–1825 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Turek, VA et al. Actuación termosensible de un flexor de origami de ADN. Adv. Función Mate. 28, 1706410 (2018).

Artículo CAS Google Académico

Kopperger, E. et al. Un brazo robótico a nanoescala autoensamblado controlado por campos eléctricos. Ciencia 359, 296–301 (2018).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kosuri, P., Altheimer, BD, Dai, M., Yin, P. y Zhuang, X. Seguimiento de rotación de enzimas de procesamiento del genoma utilizando rotores de origami de ADN. Naturaleza 572, 136–140 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Golestanian, R. Nadador molecular mecanoquímico sintético. física Rev. Lett. 105, 018103 (2010).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Golestanian, R. & Ajdari, A. Nadadores estocásticos con bajo número de Reynolds. J. física. condensa. Asunto 21, 204104 (2009).

Artículo ADS PubMed CAS Google Scholar

Douglas, SM et al. Autoensamblaje de ADN en formas tridimensionales a nanoescala. Naturaleza 459, 414–418 (2009).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rothemund, PW Plegado de ADN para crear formas y patrones a nanoescala. Naturaleza 440, 297–302 (2006).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Kilchherr, F. et al. Disección de una sola molécula de las fuerzas de apilamiento en el ADN. Ciencia 353, aaf5508 (2016).

Artículo PubMed CAS Google Académico

Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, RD & Selvin, PR Kinesin camina de la mano. Ciencia 303, 676–678 (2004).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Wagenbauer, KF et al. Cómo hacer papiroflexia de ADN. ChemBioChem 18, 1873–1885 (2017).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Jungmann, R. et al. Cinética de una sola molécula y microscopía de superresolución mediante imágenes de fluorescencia de unión transitoria en origami de ADN. Nano Lett. 10, 4756–4761 (2010).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Pänke, O., Cherepanov, DA, Gumbiowski, K., Engelbrecht, S. & Junge, W. Dinámica viscoelástica de los filamentos de actina acoplados a la F-ATPasa rotatoria: perfil de par angular de la enzima. Biografía. J. 81, 1220–1233 (2001).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Seifert, U. Termodinámica estocástica, teoremas de fluctuación y máquinas moleculares. Rep. Prog. física 75, 126001 (2012).

Artículo ADS PubMed Google Scholar

Pretorio, F. et al. Producción biotecnológica en masa de papiroflexia de ADN. Naturaleza 552, 84–87 (2017).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Gopinath, A., Miyazono, E., Faraon, A. & Rothemund, PW Ingeniería y mapeo de emisión de nanocavidades a través de la colocación precisa de origami de ADN. Naturaleza 535, 401–405 (2016).

Artículo ADS CAS PubMed Google Scholar

Gopinath, A. & Rothemund, PW Ensamblaje optimizado y acoplamiento covalente de nanoarreglos de origami de ADN de molécula única. ACS Nano 8, 12030–12040 (2014).

Artículo CAS PubMed Google Académico

Matsunaga, D. et al. Control de patrones rotacionales colectivos de rotores magnéticos. Nat. común 10, 4696 (2019).

Artículo ADS PubMed PubMed Central CAS Google Scholar

Douglas, SM et al. Creación rápida de prototipos de formas de origami de ADN 3D con caDNAno. Ácidos Nucleicos Res. 37, 5001–5006 (2009).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Engelhardt, FAS et al. Origami de ADN de tamaño personalizado, funcional y duradero con andamios de diseño específico. ACS Nano 13, 5015–5027 (2019).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kick, B., Praetorius, F., Dietz, H. & Weuster-Botz, D. Producción eficiente de ADN de fago monocatenario como andamios para origami de ADN. Nano Lett. 15, 4672–4676 (2015).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zivanov, J. et al. Nuevas herramientas para la determinación automatizada de estructuras crio-EM de alta resolución en RELION-3. Elife 7, e42166 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Nakane, T., Kimanius, D., Lindahl, E. & Scheres, SH Caracterización de movimientos moleculares en datos de partículas individuales crio-EM mediante refinamiento multicuerpo en RELION. Elife 7, e36861 (2018).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Zheng, SQ et al. MotionCor2: corrección anisotrópica del movimiento inducido por haz para mejorar la microscopía crioelectrónica. Nat. Métodos 14, 331–332 (2017).

Artículo CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rohou, A. & Grigorieff, N. CTFFIND4: estimación de desenfoque rápida y precisa a partir de micrografías electrónicas. J. Estructura. Biol. 192, 216–221 (2015).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wagner, T. et al. SPHIRE-crYOLO es un selector de partículas totalmente automatizado rápido y preciso para crio-EM. común Biol. 2, 218 (2019).

Artículo PubMed PubMed Central Google Académico

Wade, OK et al. Imágenes de superresolución de 124 colores mediante ingeniería de cinética de parpadeo DNA-PAINT. Nano Lett. 19, 2641–2646 (2019).

Artículo ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schickinger, MRJ, Funke, JJ, Pumm, AK, Engelen, W. y Bertosin E. DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies: primera versión de matlab_tirfm_movies (1.0.0). https://github.com/DietzlabTUM/matlab_tirfm_movies, https://doi.org/10.5281/zenodo.5568757 (2021).

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Este trabajo fue apoyado por una Subvención de Consolidación del Consejo Europeo de Investigación para HD (acuerdo de subvención 724261), la Deutsche Forschungsgemeinschaft a través de subvenciones otorgadas dentro del Programa Gottfried Wilhelm Leibniz (para HD), el Proyecto SFB863 ID 111166240 TPA9 (para HD) y TPA8 (para FCS), el proyecto SFB 1032 ID 201269156 TPA2 (para FCS) y la Organización Holandesa para la Investigación Científica (NWO, programa Rubicon, proyecto n.º 019.182EN.037 para WE). El trabajo ha recibido el apoyo de Max Planck School Matter to Life (para RG, FCS y HD) y el Consorcio MaxSynBio (para RG), que son financiados conjuntamente por el Ministerio Federal de Educación e Investigación (BMBF) de Alemania y el Max Sociedad Planck. Reconocemos el apoyo adicional a través de la Estrategia de Excelencia del Gobierno Federal y los Länder a través de la subvención RISE de la Red de Innovación TUM.

Presidente de Nanotecnología Biomolecular, Departamento de Física e Instituto de Ingeniería Biomédica de Múnich, Universidad Técnica de Múnich, Garching, cerca de Múnich, Alemania

Anna-Katharina Pumm, Wouter Engelen, Viktorija Kozina, Massimo Kube, Maximilian N. Honemann, Eva Bertosin y Hendrik Dietz

Cátedra de Física de Biosistemas Sintéticos, Departamento de Física, Universidad Técnica de Munich, Garching cerca de Munich, Alemania

Enzo Kopperger, Matthias Vogt, Martin Langecker y Friedrich C. Simmel

Instituto Max Planck de Dinámica y Autoorganización, Göttingen, Alemania

Jonas Isensee y Ramin Golestanian

Centro Rudolf Peierls de Física Teórica, Universidad de Oxford, Oxford, Reino Unido

ramin golestanian

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A.-KP sintetizó variantes motoras y realizó la investigación, con el apoyo de VK; NOSOTROS contribuimos a la comprensión del mecanismo del motor con simulaciones de Monte Carlo; A.-KP y EK realizaron experimentos DNA-PAINT. EK, MV y ML suministraron y operaron la configuración de microscopía TIRF personalizada con control de campo de CA utilizado para mediciones de motores, supervisada por FCS; JI realizó las simulaciones de Langevin y analizó los datos experimentales en relación con la relación de fluctuación, supervisado por RG, quien también diseñó la parte teórica de la investigación; MNH preparó las hebras de ADN de andamio personalizadas; MK y EB realizaron experimentos crio-EM; HD concibió y diseñó el proyecto de investigación y supervisó la parte experimental de la investigación. A.-KP, WE, JI, RG y HD prepararon las figuras y redactaron el manuscrito. Todos los autores editaron y comentaron el manuscrito.

Correspondencia a Ramin Golestanian, Friedrich C. Simmel o Hendrik Dietz.

Se ha presentado una patente que incluye a A.-KP, WE, EK y HD como inventores.

Nature agradece a Henry Hess y a los demás revisores anónimos por su contribución a la revisión por pares de este trabajo.

Nota del editor Springer Nature se mantiene neutral con respecto a los reclamos jurisdiccionales en mapas publicados y afiliaciones institucionales.

a, Esquema de la sección transversal de la cámara de muestra con tapón insertado. b, Ilustración de la cámara de muestras ensamblada en vista superior y esquema de la forma del canal resultante y el cableado de los electrodos (par de electrodos principal en negro, segundo par opcional en gris). c, Dimensiones del componente superior de la cámara de muestras (izquierda) y cinta adhesiva para uno (medio) y dos (derecho) pares de electrodos en uso. d, Vista superior esquemática de los rotores unidos al cubreobjetos del microscopio con un par de electrodos para un campo de CA uniaxial. e, Vista superior esquemática de los rotores unidos al cubreobjetos del microscopio con dos pares de electrodos para la posibilidad de girar el eje del campo de CA.

a, c, e, Línea continua, paisaje esquemático de energía interna para un modelo de motor simplificado con uno (a), dos (c) y seis (e) mínimos. Líneas punteadas y discontinuas, la contribución energética de un campo de CA externo aplicado a lo largo del eje 0°–180°. Los recuadros de la derecha dan las funciones de energía en coordenadas polares. b,d,f, Líneas sólidas, instantáneas del panorama de energía efectiva (es decir, la suma de la energía interna del motor más la contribución del campo) para un motor con uno (b), dos (d) y seis (f) mínimos. Las líneas discontinuas dan la trayectoria esperada del brazo del rotor en la inversión de la dirección del campo. La posición inicial por medio ciclo de campo se indica con un punto.

Imagen escaneada con láser de un gel de agarosa al 1,5 % con MgCl2 5,5 mM corrido en un baño de agua a 100 V durante 165 min en el que se sometieron a electroforesis las siguientes muestras: L, escalera de 1 kb; 1, plataforma triangular; 2, peana; 3, primera parte del brazo del rotor; 4, segunda parte del brazo del rotor (extensión); 5, plataforma triangular y dímero de pedestal; 6, dímero del brazo del rotor; 7, tetrámero completamente ensamblado. P, bolsillos; Tet, tetrámero; Dim1, dímero de plataforma triangular y pedestal; Dim2, dímero del brazo del rotor.

a, Micrografía ejemplar. Barra de escala, 50 nm. b, Promedios representativos de clase 2D. c, Histograma que representa la distribución orientacional de las partículas. d, Gráfica de correlación de capa de Fourier. e, Seis vistas diferentes del mapa de densidad de electrones.

a, Desviación estándar de la intensidad de fluorescencia de videos TIRF de una sola partícula. Barra de escala, 500 nm. Las imágenes muestran la desviación estándar de la intensidad media por píxel calculada en todos los fotogramas de los videos TIRF grabados. b, imágenes de DNA-PAINT que muestran las posiciones de la punta del brazo del rotor (naranja) en relación con la plataforma triangular (azul). Barra de escala, 500 nm.

a–c, Montaje de las primeras 76 imágenes de fotogramas individuales de las partículas dadas en la Fig. 2 (partículas izquierda (a), media (b) y derecha (c)). Cuadro verde, intensidad media de todo el vídeo. Cuadro rojo, desviación estándar de la intensidad media por píxel calculada a partir de todo el video.

A la izquierda, diagrama de dispersión de la posición de la punta del brazo del rotor utilizando un enfoque de centro de masa de ventana virtual (vwcm). Medio, energía libre calculada a partir del seguimiento del centroide (rojo) y de las intensidades de píxeles radiales (azul). Derecha, promedio de la intensidad media por píxel calculada en todos los fotogramas.

Acercamiento de trazas ejemplares de una sola partícula que muestran el desplazamiento angular acumulativo de las puntas de los brazos del rotor como se muestra en la Fig. 3a con el campo de CA apagado durante los primeros 10 s. Las trazas coloreadas son las mismas que en la Fig. 3a.

El eje del campo AC se hizo girar paso a paso en incrementos de 5° cada 1,6 s. Las líneas discontinuas indican puntos de tiempo en los que se actualizó la dirección del campo

Datos fuente

a, Desplazamiento angular cuadrático medio de motores simulados y observados experimentalmente. Comparamos datos experimentales (puntos verdes) con simulaciones realizadas en un paisaje simétrico (amarillo) y sesgado (azul). La simulación imparcial se comporta difusivamente en tiempos largos. Tanto la simulación sesgada como los datos experimentales se comportan de manera difusiva en tiempos cortos, pero hacen una transición al movimiento balístico en tiempos largos. b, Análisis de irreversibilidad de partículas motoras observadas experimentalmente sin un campo eléctrico externo. La coloración de la distribución indica el intervalo de tiempo con \(T=\frac{1}{f}=0.2\,{\rm{s}}\). A diferencia de la Fig. 4e, no se aplicó la renormalización, ya que falta una tendencia clara.

a, Imagen escaneada con láser de un gel de agarosa al 1,5 % con MgCl2 5,5 mM corrido en un baño de agua a 100 V durante 165 min en el que se sometieron a electroforesis las siguientes muestras: L, escalera de 1 kb; 1, plataforma triangular; 2, peana; 3, primera parte del brazo del rotor; 4, segunda parte del brazo del rotor (extensión); 5, plataforma triangular y dímero de pedestal; 6, dímero del brazo del rotor; 7, tetrámero completamente ensamblado. P, bolsillos; Tet, tetrámero; Dim1, dímero de plataforma triangular y pedestal; Dim2, dímero del brazo del rotor. b, Imágenes ejemplares de TEM con tinción negativa del ensamblaje del motor completo con el brazo del rotor conectado con un microscopio Philips CM100. Barra de escala, 100 nm.

Este archivo contiene las figuras complementarias 1 a 4, los escaneos de gel sin recortar, las micrografías TEM sin recortar, la secuencia de andamiaje personalizada utilizada para el pedestal y las tablas complementarias 1 a 5.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor, campo de CA primero apagado, luego encendido (trazo azul, Fig. 3a). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La partícula gira efectivamente en dirección CW cuando se enciende el campo AC. Derecha, desplazamiento angular acumulativo de la punta del rotor. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 10.082; Tiempo de vídeo (real): 40.328 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor, campo de CA primero apagado, luego encendido (trazo naranja, Fig. 3a). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La partícula gira efectivamente en dirección CCW cuando se enciende el campo de CA. Derecha, desplazamiento angular acumulativo de la punta del rotor. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 13.538; Tiempo de vídeo (real): 54.152 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor vista durante la rotación del eje del campo de CA por pasos (trazo negro, Fig. 3c). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La velocidad angular de la partícula depende de la dirección del eje del campo de CA en relación con el cuerpo del motor. El eje del campo AC se giró de 0° a 180° en incrementos de 5°. Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 16 000; Tiempo de vídeo (real): 64 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de partículas de un solo motor vista durante la rotación del eje del campo de CA por pasos (trazo azul, Fig. 3c). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La velocidad angular de la partícula depende de la dirección del eje del campo de CA en relación con el cuerpo del motor. El eje del campo AC se giró de 0° a 180° en incrementos de 5°. Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 16 000; Tiempo de vídeo (real): 64 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor vista durante el barrido de frecuencia de CA (trazo negro, Fig. 3e). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La frecuencia de CA se redujo de forma escalonada (100 Hz, 10 Hz, 5 Hz, 1 Hz). Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 16 000; Tiempo de vídeo (real): 64 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor vista durante el barrido de frecuencia de CA (trazo azul, Fig. 3e). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. La frecuencia de CA se redujo de forma escalonada (100 Hz, 10 Hz, 5 Hz, 1 Hz). Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 16.000 (reales); tiempo de vídeo: 64 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor vista durante un barrido de voltaje de CA (trazo negro, Fig. 3f). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. El voltaje de CA se incrementó gradualmente de 0 V a 60 V y luego se apagó nuevamente. Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 12.000; Tiempo de vídeo (real): 48 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor vista durante un barrido de voltaje de CA (trazo azul, Fig. 3f). A la izquierda, video sin procesar de una sola partícula ejemplar. La cruz amarilla indica la posición rastreada de la punta del brazo del rotor. El voltaje de CA se incrementó gradualmente de 0 V a 60 V y luego se apagó nuevamente. Derecha, desplazamiento angular acumulativo. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 12.000; Tiempo de vídeo (real): 48 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Ilustración del comportamiento esperado del motor en función de la orientación del eje del campo de CA. Izquierda: arriba, perfil de energía libre asumido de un motor idealizado con dos mínimos energéticos; medio, la contribución energética del campo AC externo; abajo, perfil de energía libre efectiva (graficado en coordenadas polares). La línea verde indica la orientación del brazo del rotor. Perfiles medios de energía libre trazados para coordenadas cartesianas. El punto verde indica la orientación del brazo del rotor. A la derecha, desplazamiento angular acumulativo visto durante una simulación de Langevin. En esta simulación, el eje del campo AC se mantuvo estacionario durante un número fijo de fotogramas y se registró la dinámica de partículas; luego, el eje del campo AC se actualizó a una orientación diferente, como lo indican las flechas.

Ilustración del comportamiento esperado del motor en función de la frecuencia de campo de CA. Izquierda: arriba, perfil de energía libre asumido de un motor idealizado que presenta dos mínimos energéticos; medio, la contribución energética del campo AC externo; abajo, perfil de energía libre efectiva (graficado en coordenadas polares). La línea verde indica la orientación del brazo del rotor. Perfiles medios de energía libre trazados para coordenadas cartesianas. El punto verde indica la orientación del brazo del rotor. A la derecha, desplazamiento angular acumulativo visto durante una simulación de Langevin. En esta simulación, la frecuencia del campo de CA se mantuvo estacionaria durante un número fijo de fotogramas y se registró la dinámica de partículas; luego, la frecuencia del campo de CA se incrementó en el factor de frecuencia del campo de CA indicado.

Ilustración del comportamiento esperado del motor en función de la amplitud del campo de CA. Izquierda: arriba, perfil de energía libre asumido de un motor idealizado que presenta dos mínimos energéticos; medio, la contribución energética del campo AC externo; abajo, perfil de energía libre efectiva (graficado en coordenadas polares). La línea verde indica la orientación del brazo del rotor. Perfiles medios de energía libre trazados para coordenadas cartesianas. El punto verde indica la orientación del brazo del rotor. A la derecha, desplazamiento angular acumulativo visto durante una simulación de Langevin. En esta simulación, la amplitud del campo de CA se mantuvo estacionaria durante un número fijo de fotogramas y se registró la dinámica de partículas; luego, la amplitud del campo de CA se incrementó en el factor de intensidad de campo de CA indicado.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor con un resorte de torsión durante un ciclo de bobinado (trazo inferior izquierdo, Fig. 4g). A la izquierda, video sin procesar de un rotor ejemplar con resorte de torsión durante un ciclo de bobinado (campo de CA activado) y desenrollado (campo de CA desactivado) con posición de seguimiento superpuesta del brazo del rotor (cruz amarilla). Derecha, desplazamiento angular acumulativo correspondiente. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 14.000; Tiempo de vídeo (real): 56 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

Trayectoria ejemplar de una sola partícula de motor con un resorte de torsión durante dos ciclos de bobinado (trazo superior derecho, Fig. 4g). A la izquierda, video sin procesar de un rotor ejemplar con resorte de torsión durante dos ciclos de bobinado (campo de CA activado) y desenrollado (campo de CA desactivado) con posición de seguimiento superpuesta del brazo del rotor (cruz amarilla). Derecha, desplazamiento angular acumulativo correspondiente. El video original fue adquirido con 250 cuadros por segundo. Total de fotogramas recopilados: 14.000; Tiempo de vídeo (real): 56 s. Se exportó cada segundo fotograma de la pila de imágenes original.

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Pumm, AK., Engelen, W., Kopperger, E. et al. Un motor de trinquete rotatorio de origami de ADN. Naturaleza 607, 492–498 (2022). https://doi.org/10.1038/s41586-022-04910-y

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Recibido: 16 Septiembre 2021

Aceptado: 25 de mayo de 2022

Publicado: 20 julio 2022

Fecha de emisión: 21 de julio de 2022

DOI: https://doi.org/10.1038/s41586-022-04910-y

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